本文主要內容摘自：周亞利,江泉.藜麥蛋白肽QPP-Ⅰ對小鼠抗運動性疲勞作用的研究[J].食品科技,2024,49(07):196-204.
運動疲勞主要是由于長時間運動引起機體工作能力暫時下降，糖原能量儲備量不足，導致代謝產物積累，機體內環境紊亂和產生氧化應激作用等現象[1-2]。隨著對抗疲勞的逐步深入研究，許多有效的抗疲勞生物活性肽保健產品越來越受到關注，例如：甲魚肽[3]、花生多肽[4]、鷹嘴豆多肽[5]以及大豆蛋白肽[6]等活性肽在抗疲勞方面具有廣闊的應用前景。研究表明，蛋白質經酶解作用后可得到分子質量小、活性強、安全性高且更易吸收的抗氧化肽，不僅能夠為機體提供能量，還可以通過清除機體內代謝產物和自由基等途徑起到抗運動疲勞作用[7-8]。因此，將大分子蛋白分 解成小分子肽是近年來研究的重點。
藜麥(Chenopodium quinoa Willd.)屬于莧科藜屬，是一種營養較為豐富的糧食作物，被聯合國糧食及農業組織認定為最適宜于人類食用的“全營養食品”之一，有著“超級谷物”的美譽[9-10]。 藜麥富含膳食纖維、礦物質、維生素等多種營養 物質，脂肪酸多為不飽和脂肪酸，其中蛋白質含量為13%～22%，高于傳統谷物[11-12]。此外，藜麥含有人體所需的全部必需氨基酸，是一種優質的蛋白質資源[13]，且具有降壓、降脂及對心腦血管的保護作用，抗炎、抗菌及調節腸道微生物菌群等多種生物活性。藜麥作為一種全蛋白食品在食品工業和保健品領域中具有潛在的應用價值，然而，目前關于對藜麥蛋白肽的抗疲勞功能性研究報道較少。因此，本研究探討藜麥蛋白肽的抗氧化活性和抗疲勞潛在作用，以期為藜麥蛋白進行保健食品深加工開發提供理論依據。
試驗動物簡介及分組
試驗動物為6周齡 SPF級健康昆明種雄性小鼠，體質量(22±2)g，120 只，飼養溫度為20～25 ℃、濕度為45%～65%，12 h 光/暗循環，以小鼠標準飼料常規飼養。首先將小鼠適應性飼養1周后開始正式試驗。將小鼠隨機分為5組(每組24只)，分別為空白對照組(灌胃同等體積的0.85%生理鹽水)、陽性對照組(GSH)、低劑量組(200 mg/(kg·d))、中劑量組(400 mg/(kg·d))、高劑量組(800 mg/(kg·d))，灌胃量為0.01 mL/g bw，連續灌胃6周(見表1)，每天同一時間點灌胃一次、補充飼料和飲水，試驗期間各組小鼠均自由飲水采食，觀察其體征表現，每周稱量各組小鼠的質量，觀察小鼠體質量的變化，并記錄整理測量結 果，連續灌胃給藥42 d。
小鼠力竭游泳試驗
末次灌胃1 h后，除空白組外，其他各組在小鼠尾部負重5%的鉛絲，使其在恒溫水槽中游泳(水溫(30±2)℃，水槽深度40 cm)。記錄小鼠從開始進入水中游泳至頭部全部沒 入水中10 s無法再浮出水面的時間，作為小鼠力竭游泳時間[5]。
小鼠爬桿時間測定試驗
將小鼠放置在長 30 cm的玻璃棒上，玻璃棒的直徑控制在10 mm左右，從而使小鼠身體各部位肌肉保持緊張感覺。 在整個試驗過程中，注意記錄小鼠攀爬玻璃棒的疲勞時間，詳細記錄爬桿時間[16]。
小鼠前肢抓力試驗
末次給藥30 min后，使用小鼠抓力測試儀，測試小鼠前肢抓力，每只小鼠重復試驗3次[3]。
小鼠體質量及臟器指數
試驗開始后，每周稱量并記錄小鼠的體質量。試驗結束后，將小鼠解剖，取肝臟、腎臟、胸腺以及脾臟用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸取水分后，精確稱取其質量[18]。
臟器指數計算公式如下：
臟器指數=臟器質量(g)/小鼠體質量(g)×100%
小鼠體內生化生理指標測定
在末次灌胃之后，小鼠休息30 min，然后在恒溫水槽中游泳30 min后取出，15 min后眼眶取血，離心(3000 r/ min，15 min)，取上清液即為血清，–20 ℃冰箱中保存。采用相關試劑盒測量血液中尿素氮、乳酸、MDA、T-AOC、GSH-Px、CAT和SOD活性，然后將小鼠脫臼處死，取肝臟、肌肉組織，進行勻漿處理，按照試劑盒法測定檢測小鼠肝糖原和肌糖原含量、肌肉CK和LDH含量[17]。
超濾各組分抗氧化活性的測定分析
以GSH為陽性對照，探討QPP超濾各組分對 DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，結果如圖1所示。
體外抗氧化活性結果表明：隨著質量濃度的增加，QPP各組分對DPPH 自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力均逐漸增強。其中，超濾分離后QPP-Ⅰ組分對3 種自由基的清除能力明顯高于QPP-Ⅱ、QPP-Ⅲ和 QPP-Ⅳ組的清除能力。當質量濃度為10 mg/mL 時，QPP-Ⅰ組的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力分別是 GSH的0.93、0.87、0.84倍。研究表明，多肽抗氧化活性與其分子質量具有相關性[18]。本研究表明，超濾分離得到的QPP-Ⅰ(分子質量＜3 ku)抗氧化活性顯著高于分子質量較大的多肽，這與核桃蛋白肽[19]、紅花籽[20]和紫蘇籽[21]等植物蛋白肽的研究結果相一致。因此，選擇QPP-Ⅰ(＜3 ku)組分用于后續小鼠抗疲勞試驗。
QPP-Ⅰ氨基酸測定
結果分析如表2所示，QPP-Ⅰ中的氨基酸種類齊全， 共含有17種氨基酸。其中谷氨酸的含量最高，為 12.35%；其次為精氨酸和賴氨酸，分別為11.05% 和8.88%。QPP-Ⅰ中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的34.68%，與WHO/FAO倡議的必需氨基酸值相接近，當必需氨基酸的占比越高，說明藜麥蛋白肽的營養價值越高[22]。研究表明，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸和脯氨酸與多肽的抗氧化活性有關[17,23]。在運動過程中谷氨酸主要調控機體基本能量代謝；天冬氨酸參與機體的氨 代謝，將運動過程中機體產生的有害代謝廢物排出體內，從而有效緩解運動疲勞；脯氨酸作為機體內自由基清除劑，具有良好的抗氧化活性。本研究結果表明，QPP-Ⅰ中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸和脯氨酸的含量相對較高，這表明 QPP-Ⅰ可能具有緩解運動疲勞的潛能。
小鼠抗運動疲勞的結果與分析
①QPP-Ⅰ對小鼠體質量和臟器指數的影響
由圖2可知，隨著灌胃時間的延長，小鼠體質量逐漸增加，各組小鼠體質量每周的增幅差異不顯著 (P＞0.05)，且QPP-Ⅰ不同劑量組與Control組、GSH組均無顯著差異(P＞0.05)。觀察小鼠的行為特征，各組小鼠均精神良好，未出現異常和死亡。灌胃不同劑量的QPP-Ⅰ不會影響小鼠的正常生長，且QPP-Ⅰ對小鼠無毒副作用。臟器指數是反映小鼠機體健康狀況的重要指標。由表3可知，不同劑量QPP-Ⅰ組小鼠的肝臟、腎臟、脾臟、胸腺系數與Control組、GSH組相比均無統計學差異(P＞0.05)，表明灌胃QPP-Ⅰ對小鼠機體無毒副作用。
②QPP-Ⅰ對小鼠運動能力的結果分析
負重力竭游泳時間、爬桿試驗和前肢抓力是評價運動耐力的重要指標。
如表4所示，與Control組相比，不同劑量QPP-Ⅰ組小鼠的負重游泳時間和爬桿時間均顯著提高(P＜0.05)，且呈劑量依賴方式遞增。與Control組相比，L-QPP-Ⅰ、M-QPP-Ⅰ 和H-QPP-Ⅰ組小鼠游泳時間分別延長了4.77、 9.32 min和11.32 min；爬桿時間分別延長了 1.34、1.68倍和2.15倍，表明灌胃劑量與動物延長運動時間呈正相關。L-QPP-Ⅰ組小鼠前肢抓力與Control組比較無統計學意義(P＞0.05)，而 M-QPP-Ⅰ、H-QPP-Ⅰ組小鼠前肢抓力顯著高于 Control組(P＜0.05)。上述結果表明QPP-Ⅰ具有提高小鼠運動耐力和抗疲勞的效果，能顯著增強小鼠的運動能力。
③QPP-Ⅰ對小鼠糖原儲備的影響
糖原含量是評價機體抗疲勞能力的重要指標[4]。機體內糖類物質主要以肝糖原和肌糖原的形式存在，糖原是運動期間重要的能量來源，當機體血糖不足，肌糖原通過無氧糖酵解途徑直接給肌肉組織供能，而肝糖原轉化為葡萄糖使機體維持血糖正常水平，并為機體供能。糖原儲備量越多，說明機體運動耐受力越強[2,24]。
如圖3所示，與Control組相顯著提高了18.18%、57.10%、76.20%，肌糖原含量分別顯著提高了42.67%、63.00%、92.00% (P＜0.05)，而GSH組肝糖原含量和H-QPP-Ⅰ組肝糖原含量相當，無顯著性差異(P＞0.05)，這表明 灌胃QPP-Ⅰ可以改善小鼠的能量代謝體系，增加小鼠體內肝糖原和肌糖原含量的儲備，從而提高機體的運動耐受力。此外，QPP-Ⅰ分子質量小，易被機體吸收，且必需氨基酸含量豐富，當運動過程中糖原供能不足時機體會分解蛋白質以提供能量，而QPP-Ⅰ此時能迅速為機體供能，延緩了由運動引發的供能不足而產生的疲勞，從而提高機體的抗疲勞能力。
④QPP-Ⅰ對小鼠抗疲勞運動代謝產物累積的影響
糖酵解是機體短時間內劇烈運動的主要能量來源。在進行劇烈運動時，肌肉耗氧量增加，機體葡萄糖轉換成ATP的方式將以無氧代謝為主，糖酵解反應加速，造成乳酸的大量積累，使得肌肉組織和血液pH值降低，破壞酸堿平衡并影響新陳代謝，影響心臟循環和骨骼肌系統的功能，導致運動疲勞的發生[25-26]。長時間劇烈運動機體中的糖類、脂肪分解代謝無法滿足其能量需求時，機體就會分解蛋白質供能。尿素是蛋白質代謝的最終產物，因此長時間劇烈運動會導致體內尿素氮含量明顯升高。研究指出機體的尿素氮水平與運動耐受力呈負相關，機體對運動的耐受力越好，其運動過程中尿素氮含量就越低[27,6]。因 此，乳酸和尿素氮水平通常用于評價機體的疲勞程度。
如圖4所示，與Control組相比，灌胃不同劑量QPP-Ⅰ組小鼠體內乳酸分別下降了14.23%、 22.63%和31.39%，M-QPP-Ⅰ組、H-QPP-Ⅰ組 與GSH組小鼠體內乳酸含量無顯著性差異(P＞ 0.05)；與Control組相比，不同劑量QPP-Ⅰ組小鼠體內尿素氮含量分別顯著下降了8.82%、14.57%和17.06%(P＜0.05)，其中，M-QPP-Ⅰ組、 H-QPP-Ⅰ組無顯著性差異(P＞0.05)。上述結果表明QPP-Ⅰ能夠清除運動過程中所產生的代謝廢物的累積，從而緩解機體疲勞。
⑤QPP-Ⅰ對小鼠肌肉的保護作用
LDH和CK 是反映肌肉生理活性的關鍵代謝酶。LDH在機體運動時可將乳酸轉化為丙酮酸，經三羧酸循環生成二氧化碳和水排出體外，從而減少乳酸在組織中的積累。嚴重的運動或肌肉損傷可能使LDH滲入血液，導致血液中LDH水平升高。LDH在缺氧條件下對清除血乳酸和供能具有重要作用[2,28]。劇烈運動后會造成機體的骨骼肌細胞受損，導致骨骼肌細胞中的CK外流從而引起血液中CK活性增加。因此，血清CK活性的變化常作為評價肌肉或骨骼肌損傷及恢復的重要指標，血清中CK活性越高表明骨骼肌損傷及疲勞越嚴重[17,29]。
如圖5所示，與Control組相比，L-QPP-Ⅰ、M-QPP-Ⅰ和 H-QPP-Ⅰ組小鼠運動后LDH含量分別顯著降低了 14.53%、16.71%和21.71%，CK含量分別顯著降低了15.67%、21.62%和26.50%(P＜0.05)。這表明 QPP-Ⅰ對減少LDH和CK積累具有積極作用，補充 QPP-Ⅰ能有效緩解小鼠劇烈運動后對細胞和肌肉造成的損傷，從而緩解運動性疲勞。相關研究表明，甲魚肽[2]、榛仁小分子肽[17]也能夠顯著降低小鼠血清中CK和DHL活性，有效防止小鼠因運動產生的肌肉損傷，顯著提高小鼠的抗運動疲勞作用，這均與本研究結果一致。
⑥QPP-Ⅰ對小鼠抗氧化能力的影響
自由基的過度產生是導致疲勞的主要原因，提高機體抗氧化能力有助于清除運動過程中產生的自由基，從而延緩疲勞感[29]。SOD、T-AOC、GSH-Px和 CAT是重要的抗氧化酶，可以抑制氧自由基的產生，維持機體氧化還原平衡[15]。SOD是機體內重要的抗氧化酶，在保護細胞膜的結構和功能的完整性方面至關重要[8]。CAT和GSH-Px可將機體中過量的H2O2催化分解，保護細胞膜結構和功能的完整性，提高抗氧化酶的活力有助于緩解疲勞[16]。T-AOC反映了酶和非酶系統對外部氧化應激的抵抗力以及體內自由基的代謝狀態，主要功 能是維持環境中活性氧的平衡，清除過量的自由氧，使機體處于動態平衡狀態[15]。劇烈運動會導致多不飽和脂肪酸的脂質過氧化，而MDA是細胞膜降解的脂質過氧化過程中的代謝產物之一， 因此MDA是反映生物體內氧化應激水平的重要指標。在運動過程中，MDA含量越高表明機體的疲勞程度越嚴重[5]。
由表5可知，與Control組 相比，L-QPP-Ⅰ、M-QPP-Ⅰ、H-QPP-Ⅰ組小 鼠體內SOD、T-AOC、GSH-Px和CAT活力均顯著提高(P＜0.05)，其中，M-QPP-Ⅰ、H-QPP-Ⅰ 組與GSH組相比，SOD、T-AOC、GSH-Px和 CAT活力無顯著性差異(P＞0.05)；小鼠灌胃 L-QPP-Ⅰ、M-QPP-Ⅰ、H-QPP-Ⅰ組MDA含量 與Control組相比分別下降了10.55%、17.59%和 37.69%(P<0.05)，而H-QPP-Ⅰ組小鼠的MDA含 量與GSH組相比無顯著性差異(P＞0.05)。上述結果表明QPP-Ⅰ能夠提高小鼠體內抗氧化酶活性，抑制運動過程中小鼠細胞的脂質氧化，清除因運動產生的過量自由基，從而延緩小鼠運動疲勞。
⑦抗氧化活性與抗疲勞功效的相關性分析
由表6可知，L-QPP-Ⅰ、M-QPP-Ⅰ和H-QPP-Ⅰ組中 SOD、T-AOC、GSH-Px、CAT活力和MDA抗氧化水平與小鼠運動耐力相關生化指標之間具有顯著相關性。QPP-Ⅰ可能是通過提高抗氧化酶活力，減少脂質過氧化物水平，提高骨骼肌能量代謝，保護機體細胞免受氧化應激損傷，從而起到抗運動性疲勞的功效。
